Коллагенопатии

Коллаген 6 типа весьма своеобразный представитель суперсемейства коллагенов, поскольку выполняет удивительно большое количество важнейших для клеток функций и обладает уникальными свойствами в отношении белковых доменов, надмолекулярной сборки, распределения по тканям и физиологических ролей. Шесть генов кодируют различные полипептидные субъединицы, формирующие сборки коллагена 6 типа, соответствующие альфа1-альфа6 цепям. Эти гены включают: COL6A1 и COL6A2, расположенные на 21q22.3 хромосоме; COL6A3, расположенный на 2q37.3 хромосоме; COL6A4, COL6A5 и COL6A6, расположенные в тандеме на 3q22.1 хромосоме. В результате перицентрической инверсии 3 хромосомы, ген COL6A4 разделился на 2 псевдогена COL6A3P1 и COL6A3P2, которые не в состоянии кодировать функциональные альфа-цепи, тогда как у мышей и других млекопитающих Col6a4 кодирует функциональный полипептид, экспрессирующийся в условиях регуляции развития и который может быть включен в молекулы коллагена 6 типа. Человеческий ген COL6A5 впервые был аннотирован как предполагаемый новый ген COL29A1, но более поздние работы показали его идентичность с COL6A5, что позволяет корректно аннотировать его как часть гена коллагена 6 типа.

В ряде исследований было показано, что трехспиральный мономер ColVI образован тремя различными полипептидными цепями, каждая из которых собрана в равном соотношении и кодируется отдельным геном COL6. Цепи α1(VI) и α2 (VI) имеют одинаковый размер — около 130-150 кДа и всегда объединены в тройные спирали Col6, но они не способны образовывать тройную спираль в одиночку (Colombatti et al. 1987, 1995; Colombatti and Bonaldo 1987; Lamandé et al. 1998). Цепи α1(VI) и α2(VI) ассоциируют с третьей, более длинной субъединицей Col6 чаще всего представленной α3(VI) и имеющей размер около 250-300 кДа (Engel et al. 1985; Colombatti et al. 1987, 1995; Colombatti and Bonaldo 1987; Lamandé et al. 1998), либо альтернативно одним из α4(VI), α5(VI) или α6(VI) (Gara et al. 2008, 2011). Первоначально было описано, что Col6 состоит из α1(VI): α2 (VI): α3(VI), и действительно, в большинстве клеток и тканей α3(VI) перекрывается с двумя другими цепями ColVI (Colombatti and Bonaldo 1987; Kuo et al. 1997; Cescon et al. 2015). Впоследствии открытие генов, кодирующих три дополнительные субъединицы ColVI, показало, что в некоторых районах они могут замещать α3 (VI), поскольку действительно эти альтернативные цепи обнаруживаются в более ограниченном наборе тканях, с узкоспециализированными, а иногда и взаимодополняющими паттернами экспрессии (Gara et al. 2011; Sabatelli et al. 2011, 2012).

ColVI отличается от других коллагенов по разным причинам. Во-первых, это уникальная ультраструктурная организация его внеклеточной сетки, представляющая собой разветвленную сеть микрофиламентов-бусинок, которые взаимодействуют с различными другими компонентами ЭКМ и с поверхностью различных типов клеток. Во-вторых, характерная мультимодульная первичная структура, в которой аминокислоты Gly-Xaa-Yaa, образующие непрерывную триплексическую область, составляют менее одной четвертой части молекулы и фланкируются крупными глобулярными областями, содержащими ряд глобулярные области, с рядом различных доменов, имеющих гомологию с различными белковыми модулями. В-третьих, его сложный биосинтез, обусловливающий уникальный внутриклеточный способ сборки и образование очень крупных мультимеров перед секрецией. При транскрипции и трансляции генов COL6 зарождающиеся полипептидные α-цепи поступают в эндоплазматический ретикулум, где они связываются в соотношении 1:1:1 с образованием трехспирального мономера массой около 500 кДа, стабилизированного дисульфидными связями. Затем эти мономеры собираются в антипараллельные димеры с дисульфидными связями (около 1000 кДа), которые впоследствии выравниваются за счет латеральной ассоциации с образованием тетрамеров (около 2000 кДа), соединенные другими дисульфидными связями, и которые в конечном итоге секретируются во внеклеточное пространство (Engvall et al. 1986; Colombatti et al. 1987, 1995; Colombatti and Bonaldo 1987). Вне клетки тетрамеры ColVI связываются между собой с осевой периодичностью около 105 нм. Осевая периодичность около 105 нм, они образуют более крупные нефибриллярные агрегаты с помощью нековалентных связей и, наконец, формируют сеть микрофиламентов-бусинок, которые откладываются в ЭКМ. В этих характерных микрофиламентах «бусинка на ниточке» с периодичностью 105 нм, бусинки соответствуют N- и C-концевым участкам глобулярной части глобулярным областям, тогда как линейный стержень совпадает с трехспиральной областью (Bruns et al. 1986; Baldock et al. 2003; Beecher et al. 2011). Посттрансляционные модификации цепей ColVI в эндоплазматическом ретикулуме и аппарате Гольджи также играют определенную роль в биосинтезе и нормальной активности этого белка ЭКМ. Помимо обширного образования дисульфидных связей, которые необходимы для правильной сборки цепи в мономеры, димеры и тетрамеры, в процессе синтеза ColVI подвергается обширному N-гликозилированию и гидроксилированию нескольких остатков пролина и лизина, с дальнейшим гликозилированием гидроксилированных остатков лизина до галактозил-гидроксилильных и глюкозил-галактозил-гидроксилильных остатков (Colombatti et al. 1987; Colombatti and Bonaldo 1987; Sipilä et al. 2007).

Первичная структура ColVI имеет сложную мультимодульную организацию, имеющую общую гомологию с различными неколлагеновыми белками. Все α-цепи ColVI имеют центральный коллагеновый участок, состоящий из 335-336 повторов Gly-Xaa-Yaa, фланкированный глобулярными областями, содержащими повторяющиеся модули около 200 аминокислотных остатков, имеющие сходство с белками фактора фон Виллебранда типа А (vWF-A) (Colombatti and Bonaldo 1991; Colombatti et al. 1993) (рис. 6.1). В частности, полипептиды α1(VI) и α2(VI) содержат один N-концевой домен vWF-A (названный N1), затем тройной спиральный домен и два С-концевых домена vWF-A (C1 и C2) (Bonaldo et al. 1989; Chu et al. 1989). Домены α3(VI), α4(VI), α5(VI) и α6(VI) более крупные, но аналогичным образом всегда демонстрируют триплегический коллагеновый домен, состоящий из 336 повторов Gly-Xaa-Yaa, фланкированный двумя доменами vWF-A (снова названными C1-C2) и переменным числом доменов vWF-A на N-конце — до десяти для α3 и семи для остальных цепей — (названных соответственно N1-N10). Кроме того, цепи α3-α6(VI) отличаются от цепей α1(VI) и α2(VI) наличием дополнительных доменов на С-конце, в частности, таких как:
— Цепи α3-α6(VI) содержат уникальную пролин-богатую последовательность, не имеющую гомологии с другими известными белковыми модулями (C3).
— α3(VI) имеет домен фибронектина III типа (С4) и Kunitz-подобный домен (С5).
— α4(VI) заканчивается короткой последовательностью, которая соответствует частичному Kunitz-подобному домену (C4).
— α5(VI) имеет дополнительный С-концевой модуль vWF-A (C4) и еще один уникальный домен (C5).
(Bonaldo and Colombatti 1989; Bonaldo et al. 1990; Chu et al. 1990; Fitzgerald et al. 2008; Gara et al. 2008).

Молекулярная гетерогенность и структурная сложность ColVI увеличивается за счет наличием изоформ, образующихся в результате альтернативного сплайсинга по нескольким участкам. Действительно, несколько вариантов сплайсинга, затрагивающих определенные домены vWF-A, были зарегистрированы для α2 (VI) и α3 (VI) цепей у разных видов. В клетках человека обнаружены альтернативные варианты мРНК COL6A2, кодирующие три изоформы α2 (VI), различающиеся по С-концу (Saitta et al. 1990). Было высказано предположение, что эти изоформы сплайсинга α2(VI) влияют на сборку более высокого порядка мономеров ColVI (Ball et al. 2001). Кроме того, транскрипт α3(VI) подвергается множественному альтернативному сплайсингу, в результате чего образуются различные полипептидные варианты характеризующиеся различным количеством модулей vWF-A на N-конце. Действительно, высокие уровни изоформ α3(VI), лишенных одного или нескольких доменов в области N7- N10, обнаружены как в клетках человека, так и в тканях мышей, причем генерация этих изоформ, по-видимому, регулируется клеточно и тканеспецифично (Doliana et al. 1990; Stokes et al. 1991; Zanussi et al. 1992; Dziadek et al. 2002).
Кроме того, ряд данных свидетельствует о том, что α3(VI) подвергается протеолитическомусозреванию во внеклеточном пространстве. В частности, домен C5 на С-концевой участок α3(VI) отрезается от микрофибрилл ColVI путем протеолитического расщепления сразу после секреции (Aigner et al. 2002). Дальнейшие исследования показали, что короткий белковый продукт, образующийся в результате этого расщепления, также названный эндотрофином, играет важную роль в жировой ткани и в опухолевом микроокружении (Iyengar et al.2005). В частности, было установлено, что эндотрофин, образующийся из ColVI, способствует прогрессии опухолей, он также вовлечен в фиброз жировой ткани и метаболическую дисфункцию жировой ткани при хронических заболеваниях печени (Park and Scherer 2012; Sun et al. 2014; Lee et al. 2019). В недавней работе было показано, что С-концевая часть α3(VI), содержащая C2-C5 домены, подвергается множественным протеолитическим расщеплениям под действием металлопротеиназы BMP-1 и фуриноподобных пропротеинконвертаз с образованием фрагментов различного размера. Эти расщепления происходят в процессе сборки микрофибрилл, а продукты расщепления депонируются в ЭЦМ (Heumüller et al. 2019).

Экспрессия и отложение коллагена 6 типа ColVI в ЭКМ отмечены в большом количестве разнообразных тканей. ColVI присутствует в интерстициальных соединительных тканях большинства органов, включая кожу, мышцы, сухожилия, хрящи, кости, нервы, кровеносные сосуды, легкие, печень, почки и роговицу, как во время развития, так и во взрослом состоянии (von der Mark et al. 1984; Marvulli et al. 1996; обзор см. в Cescon et al. 2015). Микрофибриллы особенно многочисленны в перицеллюлярном матриксе, окружающем поверхность хондроцитов в хряще (Zelenski et al. 2015). ColVI также присутствует в большом количестве в базальной мембране скелетных мышц и в эпидермально-дермальной области(Keene et al. 1988; Kuo et al. 1997). Несмотря на широкое распространение ColVI в ЭКМ большинства тканей, его пространственно-временная экспрессия в различных тканях тонко регулируется как в процессе эмбриогенеза, так и во взрослом состоянии. В частности, в ряде исследований, выполненных с использованием трансгенных мышей экспрессирующих различные участки гена Col6a1, показал, что регуляция транскрипции Col6a1 удивительно очень сложна и находится под контролем целого ряда цис-действующих регуляторных элементов, распределенных по очень большой части 50-фланкирующей геномной области, включая основной промотор, несколько энхансеров и сайленсеров (Braghetta et al. 1996, 1997; Fabbro et al. 1999; Girotto et al. 2000). Эти цис-действующие элементы обеспечивают высокую тканеспецифичность активации гена Col6a1, обладая при этом очень динамичной способностью к временной и пространственной адаптации в ходе развития. В частности, эти исследования показали, что регулируемая тканями экспрессия Col6a1 опирается на различные энхансерные элементы в области, простирающейся на >12 кб вверх по течению от стартового сайта транскрипции и контролирующей экспрессию в коже, сухожилиях, суставах, периферических нервах и скелетных мышцах. (Braghetta et al. 1996; Girotto et al. 2000).

Основными продуцентами ColVI в соединительных тканях являются фибробласты, которые экспрессируют ColVI в регулируемом режиме в ответ на различные условия и внеклеточные сигналы (Hatamochi et al. 1989; Olsen et al. 1989; Sardone et al. 2014, 2016; Sabatelli et al. 2016). Экспрессия и синтез ColVI также тонко регулируются в других типах клеток, включая хондроциты, шванновские клетки и адипоциты, где он является частью программы дифференцировки (Dani et al. 1989; Quarto et al. 1993; Vitale et al. 2001). Шванновские клетки продуцируют и секретируют ColVI в периферических нервах, транскрипция гена Col6a1 точно активируется из нервного гребня при стимуляции нейрогулином (Vitale et al. 2001). В периферических нервах активация Col6a1 связана с дифференцировкой незрелых шванновских клеток в миелинизирующие. Кроме того, ColVI также влияет на миелинизирующую функцию шванновских клеток, воздействуя на многочисленные регуляторные сигналы миелинизации (Braghetta, 1996; Vitale, 2001).

В скелетных мышцах ColVI является основным компонентом ЭЦМ эпимизия, перимизия и эндомизия, причем особенно много его в фундальной мембране окружающей мышечные волокна (von der Mark et al. 1984; Kuo et al. 1997). Альтернативные длинные цепи α5(VI) и α6(VI) имеют ограниченное и частично комплементарное распределение в различных областях мышечных волокон, причем α5(VI) находится в перимизии, в то время как α6(VI) более распространен в эндомизии (Sabatelli et al. 2012; Gara et al.2011). Основным типом клеток, продуцирующих ColVI в скелетной мышце, являются интерстициальные фибробласты (Braghetta et al. 2008; Zou et al. 2008). Весьма интересно, что специфичный для мышц энхансер, строго необходимый для экспрессии ColVI интерстициальными фибробластами, был идентифицирован в гене Col6a1 (Braghetta et al. 1996, 2008). Этот энхансер необходим для активации транскрипции Col6a1 в процессе эмбрионального развития и миогенеза, а присутствие клеток миогенной линии необходимо для активации энхансера в дифференцирующихся клетках фибробластов. С этим согласуется отсутствие миогенных клеток в почках конечностей эмбрионов metD/D-мутантных мышей, что заметно уменьшает отложение ColVI в развивающихся мышцах (Braghetta et al. 1997). Это указывает на интригующий неклеточный автономный механизм экспрессии и отложения ColVI в мышцах, где сигналы, передаваемые миогенными клетками, необходимы для активации экспрессии ColVI фибробластами, которые, в свою очередь, секретируют белок, позволяя ему организовываться в базальном слое дифференцирующихся миоволокон. Хотя зрелые миофибриллы не экспрессируют ColVI, транскрипция гена Col6a1 клетками миогенной линии была обнаружена на ранних стадиях развития и во время дифференцировки миобластов in vitro (Piccolo et al. 1995; Braghetta et al. 2008).

Кроме того, сателлитные клетки экспрессируют Col6a1 своеобразно и высокорегулируемым образом (Urciuolo et al. 2013), что еще больше подчеркивает сложные механизмы, лежащие в основе жесткой регуляции экспрессии ColVI в организме в ответ на различные условия и стимулы в разных тканях, включая скелетные мышцы.

Один из наиболее сложных и до сих пор не до конца выясненных аспектов биологии и функционирования ColVI связан с удивительно большим количеством его взаимодействий с другими внутриклеточными компонентами и рецепторами клеточной поверхности, которые встречаются не только в мышцах, но и широко распространены в других тканях. Действительно, было обнаружено, что ColVI непосредственно связывается с различными компоненты ЭКМ (рис. 6.2), в том числе:

— Фибриллярные коллагены I, II и V типов (Bonaldo et al. 1990; Bidanset et al. 1992; Symoens et al. 2011), коллаген IV фундальной мембраны (Kuo et al. 1997) и коллаген XIV (Brown et al. 1994).

— Фибронектин, взаимодействуя в дискретных участках ЭЦМ; дефицит ColVI влияет на организацию фибронектиновой сети (Tillet et al. 1994; Kuo et al.1997; Sabatelli et al. 2001).

— Перлекан — через трехспиральный домен α2-цепи (Tillet et al. 1994).

— Гликопротеин 1 (MAGP1), ассоциированный с микрофибриллами, через трехспиральный домен α3-цепи, вероятно, с помощью гликопротеина 1 (Finnis and Gibson 1997).

— фактор фон Виллебранда — через N-концевой участок α3-цепи (Mazzucato et al. 1999).

— Кератансульфатные протеогликаны люмикан и фибромодулин (Takahashi et al.1993).

— Фибулин-2 — через N-концевой участок α3-цепи (Sasaki et al. 1995).

— Гепарин и гиалуронан — через несколько сайтов связывания, расположенных на N-концевом участке α3-цепи (McMakahashi et al. 1995), (McDevitt et al. 1991; Specks et al. 1992).

— Протеогликаны декорин и бигликан (Bidanset et al. 1992; Wiberg et al. 2001), которые, в свою очередь, могут опосредовать непрямую связь с матрилинами, аггреканом и другими белками ЭКМ (Wiberg et al. 2003). Кроме того, декорин и бигликан проявляют способность организовывать сеть ColVI в упорядоченные структуры после связывания с ней (Wiberg et al., 2003).

— белок, связанный с доменом А фактора фон Виллебранда (WARP), через триплексический домендомена (Hansen et al. 2012).

В свою очередь, такое большое количество партнеров по связыванию может опосредовать собой несколько непрямые связи ColVI с другими внеклеточными и мембранными молекулами, тем самым регулируя тонкую структурную организацию ЭКМ в различных органах, а также взаимодействие клетки и ЭКМ в пространственно-временном аспекте. Особый интерес для скелетных мышц представляет связывание ColVI с коллагеном IV типа (Kuo et al. 1997) и с другими вышеупомянутыми матричными компонентами базовой мембраны, такими как декорин и бигликан (Zanotti et al. 2005). Следует отметить, что экспрессия декорина и бигликана изменена при некоторых мышечных дистрофиях (Zanotti et al. 2005), а бигликан также взаимодействует с саркогликаном и дистрогликановыми комплексами (Bowe et al. 2000; Rafii et al. 2006). Таким образом, все эти интеракторы указывают на возможную молекулярную связь патологических дефектов, обнаруженных при мышечных заболеваниях, связанных с ColVI. ColVI взаимодействует с несколькими рецепторами клеточной поверхности. Исследования in vitro выявили несколько субъединиц интегринов, способных связывать ColVI путем прямого взаимодействия с его трехспиральным участком, включая α1β1, α2β1, α3β1, α10β1 и αVβ3 интегрины (Aumailley et al. 1989; Pfaff et al. 1993; Tulla et al. 2001). Также было показано, что ColVI связывается с хондроитинсульфатным протеогликаном-4 (CSPG4 или NG2), и это взаимодействие запускает сигнальные события, приводящие к перестройке актинового цитоскелета (Burg et al. 1996; Tillet et al. 1997, 2002). Интересно, что дальнейшие исследования показали, что NG2 в ColVI-дефицитных мышцах (Petrini et al. 2005) играет роль в восстановлении сухожилий (Sardone et al. 2016). Еще один класс рецепторов, взаимодействующих с ColVI, представлен рецепторами токсина сибирской язвы 1 (ANTXR1/TEM8) и 2 (ANTXR2/CMG2) (Nanda et al. 2004; Bürgi et al. 2017). Биологический смысл такого широкого спектра рецепторных взаимодействий и пути передачи сигналов, возникающих при взаимодействии ColVI с рецепторами остаются в значительной степени неизвестными как в контексте их значимости для скелетной мышц, так и в контексте их значения для различных функций, выполняемых ColVI в различных тканях и типах клеток.

Врожденная мышечная дистрофия Ульриха (UCMD, OMIM #254090) была первоначально описана Отто Ульрихом как заболевание, характеризующееся ранней слабостью и «дряблостью» суставов, а также прогрессирующими контрактурами в проксимальных суставах, которое он назвал склероатонической мышечной дистрофией (Skleratonische Muskeldystrophie; Ullrich 1930). Впоследствии это заболевание обсуждалось в ряде клинических исследований в Японии и Германии (Furukawa and Toyokura 1977; Nonaka et al. 1981; Voit 1998).

В настоящее время ВМД Ульриха признана наиболее распространенным типом врожденных мышечных дистрофий в североамериканской и японской популяциях (Okada и Toyura, 1977; Nonaka и др., 1981; Voit, 1998). Заболевание проявляется симптомами, которые становятся очевидными при рождении или в течение первого года жизни. В некоторых случаях уменьшение объема движений ощущается в предродовой период (Nonaka et al. 1981; Voit 1998; Lampe and Bushby 2005).

Клинические проявления при рождении включают гипотонию и слабость в сочетании с гипермобильностью дистальных суставов. Кисти, стопы и пальцы чрезвычайно гибкие, что позволяет пальцам отгибаться назад к предплечью, а стопам — разгибаться к голени. В то же время кисть может опускаться вниз в области запястья, напоминая тем самым некоторые клинические проявления синдрома Элерса-Данлоса (СЭД).

Может иметь место врожденная pes adductus, а выступающая назад пяточная кость часто очевидна, что является характерным признаком для пациентов с типичным ВМД Ульриха.

Дополнительные симптомы при рождении могут включать врожденный вывих бедра, кривошею и кифосколиоз, а также контрактуры локтевых, тазобедренных и коленных суставов. Врожденные контрактуры суставов могут присутствовать при рождении и улучшаться в течение первых месяцев жизни, но в дальнейшем они часто повторяются, иногда вместе с новыми (Lampe and Bushby 2005; Bönnemann 2011a).

Хотя в наиболее тяжелых случаях пациенты никогда не достигают способности ходить, большинство пациентов с ВМД Ульриха приобретают способность передвигаться, часто с задержкой до двух лет, а иногда только с помощью вспомогательных устройств (Voit 1998). Однако затем они теряют способность амбулаторного передвижения примерно к 10 годам (Nadeau et al. 2009), в результате нарастания слабости и ухудшения контрактур, особенно на уровне коленей и бедер.

Мышечная слабость медленно прогрессирует, но возникающая инвалидность усугубляется прогрессирующими контрактурами крупных суставов, в частности, плечевых, локтевые, тазобедренные, коленных, голеностопных и позвоночника. Часто серьезной проблемой является сколиоз, который может развиться из кифосколиоза, присутствующего при рождении, или начать проявляться до потери способности к передвижению (Nadeau et al. 2009).

Наличие контрактур сопровождается гипермобильностью дистальных суставов, обычно в межфаланговых суставах, а длинные сгибатели пальцев имеют выраженные контрактуры.

Дыхательная недостаточность является еще одним критическим аспектом заболевания, возникающим по мере прогрессирования и обусловленным слабостью диафрагмы в сочетании с ригидностью грудной стенки (Nadeau et al. 2009; Bönnemann 2011). Использование ночной неинвазивной вентиляции обычно является достаточным для лечения этой проблемы в течение нескольких лет, однако неспособность обеспечить адекватную поддержку пациентов с признаками дыхательной недостаточности приводит к смерти в относительно короткие сроки, обычно во втором десятилетии жизни (Nadeau et al. 2009).

Еще одной пораженной тканью при ВМД Ульриха является кожа. Действительно, избыточное образование рубцов, в том числе крупных келоидов, наблюдается у ряда пациентов, а фолликулярный гиперкератоз часто обнаруживается на разгибательных поверхностях верхних и нижних конечностей. Последняя дерматологическая находка, как правило, встречается у пациентов с тяжелой формой заболевания и представляет собой полезный диагностический параметр в общем контексте клинической картины. Также описана мягкая бархатистая кожа на ладонях и подошвах (Kirschner et al. 2005; Bönnemann 2011a).

Некоторые преходящие трудности с кормлением и глотанием могут наблюдаться в неонатальном периоде (Nadeau et al. 2009).

Миопатия Бетлема (БМ, OMIM #158810) впервые была описана в 1976 году Jaap Bethlem и George K. van Wijngaarden как аутосомно-доминантно наследуемое доброкачественное нервно-мышечное заболевание, поражающее 28 человек из голландской родословной (Bethlem and Wijngaarden 1976).

Первые симптомы появляются примерно на пятом году жизни, они могут включать умеренную мышечную слабость и атрофию, кривошею и сгибательную контрактуру локтевых, межфаланговых и голеностопных суставов. Несмотря на раннюю манифестацию, заболевание характеризуется легким течением. Аналогичные семьи были описаны и в других исследованиях, что позволило подчеркнуть характерные клинические особенности раннего начала и медленного прогрессирования синдрома (Mohire et al. 1988).

Данные, полученные в ходе всемирных исследований, позволили установить уникальные клинические особенности этого заболевания. Хотя первоначально БМ описывалась как легкая миопатия с основным проявлением в зрелом возрасте, случаи уменьшения движений плода, неонатальной гипотонии, прогрессирования синдрома позволили установить уникальные клинические особенности этого заболевания (Jöbsis et al. 1999).

Обычно начало приходится на первое или второе десятилетие жизни, однако некоторые взрослые пациенты даже не подозревают о наличии у них легких контрактур или умеренной слабости (Merlini et al. 1994), поэтому в ряде случаев возраст начала заболевания точно установить не удается.

Развитие контрактур является отличительным признаком этого заболевания. Врожденные контрактуры обычно проходят в первые два года жизни, а у детей младшего возраста наблюдается гипермобильность дистальных отделов суставов. В дальнейшем новые контрактуры, как правило, появляются в первом десятилетии жизни и в подростковом возрасте, затрагивая запястья, локти, длинные сгибатели пальцев, плечи и ахилловы сухожилия (Jöbsis et al. 1999; Lampe and Bushby 2005; Bönnemann 2011a). После развития эти контрактуры часто остаются стабильными, но могут усугубляться, становясь инвалидизирующими. Например, контрактуры длинных сгибателей пальцев могут приводить к ограничению функции кисти. Невозможность полного разгибания пальцев является типичным «признаком Бетлема». Контрактуры могут также влиять на позвоночник и вызывать ригидность позвоночника у некоторых пациентов, хотя это состояние является умеренным по сравнению с ВМД Ульриха (Jöbsis et al. 1999; Bönnemann 2011a).

Пациенты обычно демонстрируют умеренную преимущественно проксимальную слабость и атрофию, при этом может наблюдаться и дистальная слабость (Jöbsis et al. 1999). В детском возрасте мышечная слабость может оставаться стабильной, но медленно прогрессирующее нарастание слабости начинается в третьем-четвертом десятилетиях жизни.

Таким образом, сочетание слабости и контрактур может привести к затруднению ходьбы, причем более чем две трети пациентов в возрасте старше 60 лет нуждаются в вспомогательных средствах для передвижения (Jöbsis et al. 1999).

Потенциальным осложнением при БМ является развитие дыхательной недостаточности, обусловленной сочетанием ригидности грудной клетки и слабости диафрагмальных мышц (Haq et al. 1999). При наличии респираторных симптомов некоторые пациенты нуждаются в ночной респираторной поддержке (Jöbsis et al. 1999).

Поражение кожи аналогично описанному при ВМД Ульриха, хотя такие особенности, как фолликулярный гиперкератоз и образование келоидов или феномена»папиросной бумаги», встречаются чаще, чем мягкая и бархатистая кожа (Lampe and Bushby 2005; Nadeau and Muntoni 2008).

Несмотря на ряд характерных клинических проявлений, фенотип миопатий, связанных с ColVI может быть очень разнообразным. У некоторых пациентов может наблюдаться преимущественно проксимальная слабость и очень мало контрактур, что напоминает поясно-конечностную мышечную дистрофию (Scacheri et al. 2002; Jokela et al. 2019). У других пациентов может наблюдаться относительно слабость, но более тяжелый и диффузный фенотип контрактур. В частности, Merlini описал двух братьев и сестер с клиническим диагнозом аутосомно-рецессивного миосклероза (OMIM #255600), которые были гомозиготны по мутации в гене COL6A2. У пациентов наблюдались умеренная слабость, мышцы с «деревянной» консистенцией и выраженные контрактуры множества суставов, среди которых жевательных мышц, шеи, плеч, локтей, пальцев, коленей и ахилловых сухожилий (Merlini et al. 2008). Поэтому особое внимание к этим аспектам фенотипа необходимо для однозначной клинической диагностики в этой гетерогенной группе заболеваний

Ряд мутаций, связанных с БМ и ВМД Ульриха, был описан в генах COL6Α1, COL6Α1, COL6Α2, COL6Α3 и COL6A6 (Bushby et al. 2014; Hunter et al. 2015; Lamandé and Bateman, 2018). Широкий генетический спектр лежит в основе клинической клинической вариабельности этих расстройств. Впервые о причинной роли мутаций гена COL6 в наследственных мышечных нарушениях было сообщено в 1996 году Jöbsis и соавт. для БМ (Jöbsis et al. 1996) и в 2001 году Бертини и соавт. для ВМД Ульриха (Camacho Vanegas et al. 2001). Хотя первоначально считалось, что рецессивные мутации гена COL6 вызывают ВМД Ульриха, а доминантные мутации лежат в основе БМ, это различие утратило свою актуальность. Многие из мутаций были подробно обобщены Lampe и Bushby в 2005 году и Lamandé и Bateman (2018).

Для ВМД Ульриха подавляющее большинство рецессивно действующих мутаций, по-видимому, приводит к появлению преждевременных терминирующих кодонов (PTC), что приводит к нонсенс-опосредованному распаду мРНК и потере мутировавшей цепи. Поскольку у гетерозиготных носителей мутаций COL6A2 и COL6A3 PTC-мутации не имеют выраженной патологии, по-видимому, α2(VI) или α3(VI) хорошо переносится, в то время как гаплонедостаточность α1(VI) в некоторых случаях (Peat et al. 2007; Baker et al. 2007) вызывала БМ, а в других случаях не имела вредных последствий (Giusti et al. 2005; Foley et al. 2011). Когда мутации ПТК происходят в альтернативно сплайсированных экзонах, клинические проявления обычно менее тяжелые (Demir et al. 2002; Lampe et al. 2005; Giusti et al. 2005; Okada et al. 2007). Дополнительные рецессивные мутации включают изменения сайтов сплайсинга, которые приводят к внекадровому пропуску экзонов (Camacho Vanegas et al. 2001; Ishikawa et al. 2002; Lucarini et al. 2005). Значительная часть пациентов со спорадической ВМД Ульриха имеет de novo доминантные мутации в генах COL6 (Baker et al. 2005; Pan et al. 2003; Okada et al. 2007; Lampe et al. 2005, 2008). Эти мутации, как правило, мутации сайтов сплайсинга или геномные делеции, приводящие к внутрикадровому пропуску экзонов, кодирующих N-концевую область тройного спирального домена, не затрагивая при этом остатки цистеина, ответственные за образование димера (Pan et al. 2003; Pepe et al. 2006; Lampe et al. 2008). Как следствие, цепь с удаленной последовательностью в трехспиральной области эффективно включается в мономер, а поскольку цистеиновый остаток все еще присутствует, возможна сборка димеров и тетрамеров более высокого порядка. Это приводит к тому, что аномальные тетрамеры секретируются в ЭМК с последующим доминантно-негативным эффектом на сборку микрофибрилл (Baker et al. 2005; Pan et al. 2003; Lampe et al. 2008). В отличие от этого, внутрикадровые мутации с пропуском экзонов, происходящие на С-конце тройного спирального домена, не включаются в гетерофибриллярную сборку и действуют рецессивно (Baker et al. 2005; Demir et al. 2002; Ishikawa et al. 2004; Lampe et al. 2005, 2008). Интересно, что пациенты с доминантно-негативными мутациями могут приобретать способность передвигаться в течение определенного периода времени.

Что касается БМ, то выявленные к настоящему времени мутации генов COL6 в основном носят доминантный характер. Обычно наблюдаемые изменения представляют собой миссенс-мутации остатка глицина в связке Gly-Xaa-Yaa N-концевой части тройного спирального домена, либо цепей α1(VI), α2(VI) или α3(VI) (Jöbsis et al. 1996; Pepe et al. 1999a; Scacheri et al. 2002; Lampe et al. 2005; Lucioli et al. 2005). Эти мутации действуют доминантно-отрицательно, поскольку вносят перегиб в тройной спиральный домен тетрамеров (Lamandé et al. 2002). Эффекты аутосомно-доминантных замен в последовательности Gly-Xaa-Yaa различны и зависят от того, в каком именно положении последовательности они происходят. Поэтому они могут вызывать различные клинические фенотипы, и если влияние на сборку ColVI более выражено, то фенотип может даже попадать в ВМД Ульриха по степени тяжести (Okada et al. 2007; Pace et al. 2008). Другой частой мутацей в БМ является гетерозиготный внутрикадровый пропуск экзона 14 гена COL6A1, что приводит к образованию аберрантной цепи α1(VI), в которой отсутствует остаток цистеина, необходимый для работы гена COL6A1, что приводит к секреции половины COL6 (Lamandé et al. 1999; Pepe et al. 1999b; Pan et al. 2003; Lucioli et al. 2005). Другие мутации, описанные в БМ, включают миссенс-мутации, кроме глициновых замен в тройном спиральном домене (Scacheri et al. 2002; Lucioli et al. 2005). Следует отметить, что не все мутации, о которых сообщалось до сих пор, были полностью проанализированы на предмет их патогенного влияния на ColVI. Поэтому следует проявлять осторожность, так как многие полиморфизмы в генах COL6 не полностью каталогизированы, и может быть трудно установить, является ли новое изменение последовательности у пациента полиморфизмом или патогенным вариантом (Bönnemann 2011; Lamandé and Bateman 2018).

Коллаген 4 типа

Коллаген IV (ColIV) является основным компонентом базальной пластинки мышц и присутствует в различных изоформах в синаптической и экстрасинаптической областях. Шесть генов (COL4A1-COL4A6) кодируют субъединицы ColIV у человека. Наиболее распространенная изоформа ColIV в базальной пластинке мышц — [α1(IV)2α2(IV)], в то время как [α3(IV)α4(IV)α5(IV)] и [α(IV)2α6(IV)] ограничены НМС (Singhal and Martin2011; Gatseva et al. 2019). Мутации в генах COL4A1 и COL4A2, кодирующих ColIV α1 и α2 цепи, могут вызывать мультисистемное заболевание, характеризующееся наличием цереброваскулярных нарушений с вариабельными глазными, мышечными и почечными поражениями. Патология мышц была описана у нескольких человек с патогенными вариантами COL4A1 и COL4A2 (Jeanne and Gould 2017) и в животных моделях (мыши и дрозофила) с мутациями в COL4A1 и COL4A2 (Labelle-Dumais et al. 2011; Kelemen-Valkony et al. 2012; Kiss et al. 2019). В частности, у мышей, несущих гетерозиготную мутацию сайта сплайсинга Col4a1 мутации, приводящей к пропуску экзона 41 (Col4a1+/Δex41), наблюдается генетически сложная скелетная миопатия со снижением силы хвата и увеличением числа центрально-ядерных клеток (Labelle-Dumais et al. 2011). Кроме того, у мышей Col4a1+/Δex41 наблюдаются дисгенез глазного дна и дефекты локализации нейронов, которые, наряду с миопатией, характерны для болезни мозга и синдрома Уокера-Варбурга (Labelle-Dumais et al. 2011). Таким образом, эта животная модель очень полезна для выяснения патофизиологических механизмов, лежащих в основе COL4A1-связанной миопатии у человека. Недавние работы на примере мутантных мышей Col4a1 показали, что тканеспецифическая аллельная и механистическая гетерогенность способствуют возникновению нервно-мышечной патологии, вызванной дефицитом α1(IV) (Labelle-Dumais et al. 2019). Полученные данные свидетельствуют о важности [α1(IV)]2α2(IV) и предполагают, что потенциальный терапевтический подход, направленный на стимулирование [α1(IV)]2α2(IV) сети, может быть использован в качестве платформы ЭКМ, способной вызывать различные тканеспецифические реакции (Labelle-Dumais et al. 2019).

Коллаген 5 типа

ColV — фибриллярный коллаген, кодируемый тремя генами (COL5A1-COL5A3) и встречающийся в различных изоформах в интерстициальном ЭЦМ различных тканей, включая сухожилия, связки и мышцы. Он играет ключевую роль в модуляции коллагена I (ColI), фибриллогенеза и в регуляции диаметра фибрилл (Birk et al. 1990). Col5a1 null мыши погибают на ранних стадиях эмбриогенеза из-за нарушения формирования коллагеновых фибрилл, в то время как у гетерозиготных Col5a1+/-мышей наблюдается уменьшение и изменение размера фибрилл ColI (Wenstrup et al. 2004). У человека мутации генов, кодирующих цепи COLV, являются причиной классических форм ЭДС, а значительное число пациентов с ЭДС несет гетерозиготные доминантные мутации в COL5A1 и COL5A2 (Malfait et al. 2010). Несмотря на то, что до настоящего времени не было описано никаких серьезных миопатических признаков у пациентов с ColV-ассоциированной ЭБС, исследования на мышах показали, что ColV является критическим компонентом ниши покоящихся мышечных СК, поскольку его истощение приводит к аномальному вступлению в клеточный цикл и постепенному уменьшению пула стволовых клеток, что позволяет предположить о потенциально игнорируемой роли ColV и в мышцах (Baghdadi et al. 2018). Интересно, что мутация COL5A1, отменяющая расщепление N-пропептида и влияющая на организацию коллагеновых фибрилл, была обнаружена у пациента с мышечными контрактурами и слабостью, а также дефектами кожи и нервов (Badara, 2016). Интересно, что в недавнем исследовании также было обнаружено истощение ColV в ЭКМ пациентов с дефектами COL6A1 (Delbaere et al. 2020), что подтверждает актуальность взаимодействия между ColVI и ColV (Symoens et al. 2011).

Коллаген 9 типа

Легкая миопатия наблюдается также у некоторых пациентов с множественной эпифизарной дисплазией (МЭД) — дегенеративным заболеванием хрящевой ткани, вызванным мутациями в генах, кодирующих коллаген IX (ColIX), белок олигомерного матрикса хряща и матрилин-3. В частности, мутации генов COL9A2 и COL9A3, кодирующих цепи α2(IX) и α3(IX) цепей, обнаруживаются у некоторых лиц, страдающих MED-связанной миопатией, с проксимальной мышечной слабостью и гистологическими миопатическими признаками, такими как изменение размера миофибрилл (Bönnemann et al. 2000; Jackson et al. 2009). Следует отметить, что ColIX экспрессируется в основном в ЭКМ хряща, и роль этого белка ЭКМ в скелетных мышцах ранее не была установлена. Таким образом, данные, полученные у пациентов, страдающих MED с сопутствующей миопатией, позволяют предположить, что ColIX также играет определенную роль в костно-мышечной системе.

Коллаген 12 типа

Синдромы человека, связанные с поражением мышечной и соединительной ткани, также ассоциированы с патогенными вариантами в гене COL12A1, кодирующем α1-цепь коллагена XII (ColXII). Действительно, гетерозиготные или гомозиготные мутации в COL12A1 были зарегистрированы у пациентов со смешанным миопатическим синдромом и синдромом Элерса-Данлоса (СЭД) (Hicks et al. 2013; Zou et al. 2014; Punetha et al. 2017; Witting et al. 2018). У пораженных лиц наблюдается гипермобильность дистальных суставов и контрактуры проксимальных суставов, а также мышечная гипотония и слабость, задержка моторного развития. Кроме того, у них наблюдаются сколиоз или кифоз и аномальное рубцевание. На основании этого характерного фенотипа это заболевание было классифицировано как миопатическая СЭД (Malfait et al. 2017). Интересно, что у нокаутных мышей Col12a1 наблюдается мышечная слабость со снижением силы хвата и изменениями соединительной ткани, такими как хрупкость костей, кифосколиоз, и низкий рост (Zou et al. 2014). Благодаря этой мышиной модели стало возможным выявить функцию ColXII в скелетных мышцах, показав, что его дефицит вызывает структурные изменения в мышечном ЭКМ и влияет на трансдукцию силы в блоке мышца-сухожилие-кость (Zou et al. 2014). В недавнем исследовании 78 пациентов, отвечающих клиническим критериям миопатической ЭБС, Malfait выявил среди этой когорты четыре новых гетерозиготных патогенных варианта COL12A1, один, COL12A1 вариант неясной значимости и биаллельные патогенные варианты в COL6A1 (Delbaere et al. 2020). В целом эти результаты указывают на значительное клиническое совпадение между миопатическим ЭБС и COL6-связанными миопатиями, что указывает на то, что в диагностике этого спектра заболеваний необходимо учитывать вовлечение как ColVI, так и ColXII. Эти результаты также согласуются с результатами независимых исследований, указывающих на то, что ColVI и ColXII образуют функциональные комплексы в ЭКМ (Izu et al. 2016).

Коллаген 13 типа и Q типа

Два других компонента суперсемейства коллагена, а именно коллаген XIII (ColXIII) и коллаген Q (ColQ), связаны с врожденными миастеническими синдромами (ВМС) — группой наследственных заболеваний с нарушением нервно-мышечной передачи, обусловленным аномальной передачей сигнала в двигательной пластинке и характеризующихся мышечной слабостью, усиливающейся при нагрузках, и рецидивирующими респираторными заболеваниями. ВМС представляют собой обширную группу разнообразных заболеваний, различающихся по возрасту начала и спектру симптомов (от переменной слабости до инвалидности) сильно варьируют у разных людей (Rodríguez Cruz et al. 2018). ColXIII — это белок, пронизывающий мембрану и ЭКМ, играющий важную роль в формировании и функционировании NMJ (Heikkinen et al. 2019). У человека гомозиготные рецессивные мутации гена COL13A1 вызывают синаптическую базальную ламина ассоциированную ВМС 19-го типа (OMIM #616720) (Engel et al. 2016). Симптомы заболевания включают гипотонию, мышечную слабость, трудности с дыханием и кормлением, а также проблемы с дыханием вскоре после рождения, однако выраженность мышечной слабости и прогрессирование заболевания варьируют (Rodríguez Cruz et al. 2019). Исследования, проведенные Pihlajaniemi на различных инженерных моделях мышей, четко подчеркнули критическую роль ColXIII для нормального функционирования опорно-двигательного аппарата. Трансгенная мышь (Col13a1N/N), продуцирующая аберрантную форму ColXIII, лишенную короткого цитозольного и трансмембранного доменов, подтвердила важнейшую роль ColXIII для целостности мышц. У этих мышей мутантный ColXIII не локализуется правильно на плазматической мембране, а депонируется в прилегающем к ней ЭКМ. У мышей Col13a1N/N наблюдаются миопатические черты, а в скелетных мышцах наблюдаются аномальные миофибриллы с волнистой межфазной границей между сарколеммой и базальной мембраной, дезорганизацией миофиламентов и Z-дисков, вакуолизацией. Эти дефекты прогрессируют, а физические нагрузки вызывают усиление дегенерации миофибрилл (Kvist et al. 2001). Дополнительные работы, проведенные на ColXIII null (Col13a1-/-) и у мутантных мышей, экспрессирующих только трансмембранную форму ColXIII (Col13tm/tm), показали, что ColXIII регулирует созревание NMJ и необходим для регенерации и функционального восстановления НМЖ после травмы (Latvanlehto et al. 2010; Zainul et al. 2018). Дальнейшие исследования на Col13a1-/-мышах и у трансгенных мышей, сверхэкспрессирующих ColXIII, подтвердили ключевую роль ColXIII в НМС и подчеркнули важность его правильной экспрессии и локализации для кластеризации AChR, а также для правильного формирования и функционирования НМС (Härönen et al. 2017; Härönen et al. 2019).
ColQ, соответствующий коллагеноподобному хвосту, который крепит асимметричную ацетилхолинэстеразу (АХЭ) к базальной пластинке, экспрессируется преимущественно в быстрых мышцах на уровне НМС. ColQ закрепляет АХЭ в синаптической щели и связывает перлекан и мышечно-специфическую киназу (MuSK), через которую он осуществляет внутриклеточную сигнализацию и контролирует кластеризацию AChR (Ohno et al. 1998). Эти свойства делают ColQ важным участником формирования и стабильности NMJ, а также целостности мышц. Мутации в гене COLQ человека приводят к развитию ВМС, связанного с дефицитом AChE, классифицируемого как ВМС типа 5 (OMIM #603034) (Engel et al. 2016). Основными симптомами заболевания являются глобальная и моторная задержка развития, мышечная гипотония, утомляемость и дыхательная недостаточность (Mihaylova et al. 2008). Интересно, что мутации в С-концевом домене ColQ нарушают его взаимодействие с MuSK и компонентами базальной мембраны на уровне NMJ (Nakata et al. 2013; Arredondo et al. 2013). Мыши с дефицитом ColQ (Colq-/-) являются моделью этого заболевания. У них наблюдается повышение уровня как эмбриональных ɣ-AChR, так и взрослых ɛ-AChR субъединиц, что приводит к смешению зрелых и незрелых AChR в НМС взрослых Colq-/- мышей. Помимо миастении, у Colq/- животных наблюдается атрофия мышц, в первую очередь быстрых, и дефекты их развития (Sigoillot et al. 2016). Дополнительные исследования на ColQ-дефицитных животных были направлены на изучение эффективности потенциальных методов лечения, таких как терапия агонистами β2-адренергических рецепторов или AAV-опосредованная экспрессия ColQ (McMacken et al. 2019; Ito and Ohno 2018).

Коллаген 15 типа

Еще одним типом коллагена, играющим роль в поддержании мышечного гомеостаза, является коллаген XV (ColXV). Модели животных, созданные для изучения биологической роли ColXV, позволили установить, что истощение этого белка ЭКМ приводит к дегенерации мышц. Анализ мышц мышей, нокаутных по ColXV (Col15a1-/-), позволил выявить миопатический фенотип, характеризующийся наличием дегенерирующих миофибрилл, центрально нуклеированных миофибрилл и изменений в размерах миофибрилл. Впервые эти изменения были обнаружены в возрасте 3 месяцев и становились более выраженными в старшем возрасте мышей. Кроме того, мыши Col15a1-/- демонстрируют повышенную уязвимость к индуцированному физическими нагрузками повреждению мышц (Eklund et al. 2001). Морфант-эмбрионы зебрафиш, у которых снижена экспрессия транскриптов ColXV, демонстрируют серьезное нарушение развития мышц. Нокдаун ColXV приводит к дефекту дифференцировки нотохорда и изменению формирования медленных и быстрых мышц у зебрафиш, при этом увеличивается количество медиальных быстрых мышц. Увеличение числа медиальных быстро сокращающихся мышечных волокон позволяет предположить, что что сигналы Hedgehog, идущие от нотохорда, усиливаются при дефиците ColXV (Pagnon-Minot et al. 2008). Дальнейшая работа на зебрафишах показала, что ColXV участвует в генетической программе медленных мышц, являясь прямой мишенью сигналов Hedgehog/Gli. Изменение функции ColXV приводит к дефектам поиска пути в аксонах мотонейронов, что приводит к атрофии мышц и нарушению их подвижности (Guillon et al. 2016).

Коллаген 22 типа

Заметный мышечный фенотип был также обнаружен в моделях зебрафиш для коллагена XXII (ColXXII). ColXXII является характерным компонентом ЭКМ МТЖ — высокоспециализированной структуры, участвующей в передаче мышечного усилия сухожилиям (Koch et al. 2004). Нокдаун ColXXII в морфных эмбрионах зебрафиш col22a1 вызывает мышечную дистрофию, характеризующуюся сильным уменьшением количества складок МТЖ и изменениями в структуре миосептальных структур, что в конечном итоге приводит к снижению сократительной силы и повышению восприимчивости к индуцированному сокращением отрыву миофибрилл (Charvet et al. 2013).

Мышечная слабость и контрактуры, ассоциированные с разной степенью гипермобильности суставов, описаны при многих миопатиях раннего начала, включая другие ВМД и врожденные миопатии (в частности, мутации, связанные с генами SEPN1, LAMA2 и RYR1), но также и при поясно-конечностных мышечных дистрофиях и других заболеваниях соединительной ткани (синдром Элерса-Данлоса и подобные ему синдромы). У пациентов с выраженной скованностью позвоночника и онтрактурами локтевых суставов, фенотип похож на мышечную дистрофию Эмери-Дрейфусса, связанную с мутациями в генах LMNA, EDM, FHL-1. Отсутствие или значимое повышение уровня КФК, а также отсутствие поражения сердца и выраженный тигроидный МР-паттерн с высокой вероятностью говорят в пользу миопатии, связанной с коллагеном 6 типа. Отклонения описанные в четырехглавой мышце при других мышечных дистрофиях (дисферлин, кальпаин 3 типа) могут напоминать симптом «раскатанной лепешки» при колаген-6-связанной миопатии, но полосы не наблюдаются на других уровнях, что подтверждает важность МРТ всего тела.

Клинический диагноз миопатий, связанных с ColVI, основывается на распознавании типичных клинических признаков, которые могут свидетельствовать о картине, совместимой либо с ВМД Ульриха, либо БМ или патологией промежуточной степени тяжести. Биопсия мышц может быть очень полезной для клинической дифференциации этих заболеваний, поскольку для каждого из них характерны свои мышечные изменения (Mercuri et al. 2010; Deconinck et al. 2010). Например, иммуногистохимический анализ на количество и локализацию ColVI в мышечной ткани представляет собой полезный диагностический инструмент. В рецессивных случаях ВМД Ульриха окрашивание ColVI обычно отсутствует или сильно снижено (Ishikawa et al. 2002), в то время как доминантные мутации ВМД Ульриха приводят к сильному мечению иммунореактивности ColVI в ЭКМ, но белок не локализован должным образом в базальной мембране (Pan et al. 2003; Ishikawa et al. 2004). Эта неправильная локализация, которая предполагает, что ColVI секретируется, но не откладывается должным образом, может быть подчеркнута с помощью двойного мечения маркерами базальной мембраны, такими как коллаген IV, ламинин или перлекан. Однако это характерно не для всех доминантных мутаций, поскольку при более легкой БМ коллаген IV не выводится из состава базальной мембраны, хотя она выглядит дезорганизованной (Pan et al. 2003). Следует отметить, что у некоторых пациентов с нарушениями ColVI, при которых наблюдается нормальное окрашивание на α1(VI)/α2(VI)α/3(VI), мечение α6(VI) снижено, что позволяет предположить, что иммуноокрашивание на α6(VI) может иметь диагностическое значение (Tagliavini et al. 2014). Более важным представляется анализ синтеза, сборки и отложения ColVI в ЭКМ в культурах дермальных фибробластов пациентов с мутациями ColVI: от полного отсутствия или выраженного снижения с внутриклеточным удержанием в ВМД Ульриха, до более мягких нарушений в БМ (Lamandé et al. 1999, 2002; Jimenez-Mallebrera et al. 2006; Baker et al. 2007; Hicks et al. 2008; Merlini et al. 2008b; Gualandi et al. 2009; Tooley et al. 2010).

Что касается гистологического анализа биоптатов мышц, взятых у пациентов с БМ и ВМД Ульриха, результаты могут быть очень разнообразными, в зависимости от возраста и тяжести заболевания. На первых стадиях наиболее выраженной является атрофия миофибрилл (Schessl et al. 2008), а по мере прогрессирования заболевания дистрофические признаки, такие как изменчивость размеров волокон, дегенерация миофибрилл и усиление эндомизиального фиброза (Higuchi et al. 2003). Кроме того, у некоторых пациентов может наблюдаться атрофия волокон I типа (Schessl et al. 2008). Также оправдано применение проточной цитометрии.

Еще одним полезным инструментом в диагностике ColVI-связанных миопатий и их дифференциации от LMNA-связанных мышечной дистрофии Эмери-Дрейфуса и других миопатий, сопровождающихся контрактурами и ригидностью позвоночника, является магнитно-резонансная томография мышц (Mercuri et al. 2010; Deconinck et al. 2010). Действительно, магнитно-резонансная томография выявляет отчетливый характер поражения мышц при заболеваниях, связанных с ColVI, с характерным концентрическим характером изменений, при котором дегенеративные изменения и замещение жировой и соединительной тканью наблюдаются преимущественно в наружной части мышцы, а не в центральной (Mercuri et al. 2005; Bönnemann 2011a).

Большинство пациентов демонстрируют выраженные изменения во множестве мышц по всему телу, кроме головы. Чередующиеся полосы гипо- и гиперинтенсивного сигнала от сохраненных и замещенных жировой тканью мышц на Т1-взвешенных изображениях дает полосатый (тигроидный) паттерн. Эти полосы неизменно одинаковы в каждой мышце. Этот признак может быть идентифицирован как подобный «раскатанной лепешке» в четырехглавой мышце бедра, как яркая вертикальная тень в передней прямой мышце бедра и как ободок из жирового инфильтрата между камбаловидной и икроножной мышцами. Кроме того, аналогичные горизонтальные полосы обнаруживаются в трехглавой мышце плеча; множественные радиальные линии в дельтовидной мышце и в мышцах, разгибающих поясницу; линии вокруг ягодичной мышцы (во фронтальных срезах) и крупные перпендикулярные полосы в маленьких мышцах, таких как подлопаточная или надостная. Фронтальные срезы полезны при поиске вертикальных полос в таких мышцах как большая ягодичная. У пациентов с легкой степенью поражения или в молодом возрасте, полосы могут быть не столь четко выражены, и поэтому МРТ мышц может быть не очень отчетливой. Тем не менее, жировая инфильтрация – достаточно избирательный признак. Преимущественно поражаются поясничные, ягодичные мышцы, а также мышцы бедра и голени.

Наиболее сохранны мышцы бедра: передняя прямая мышца бедра, портняжная, тонкая мышцы – они помогают распознать профиль пациента с клиническими признаками коллагенопатии. Важно отметить, что у таких пациентов диагностические «полосы» представлены в ограниченном количестве мышц (бедра и руки особенно чувствительны к этим изменениям).

Таким образом, МРТ всего тела значительно повышает диагностический эффект у пациентов без специфических находок в бедре, выявляя диффузный тигроидный паттерн в нижних конечностях.

Периферическое преобладание патологии можно оценить и при ультразвуковом исследовании мышц, когда дегенерация вокруг центральной фасции прямой мышцы бедра имеет характерный вид (Bönnemann et al. 2003).

Поэтому сочетание клинических и генетических данных, а также иммуногистохимических и белковых исследований является основополагающим для постановки четкого диагноза в гетерогенной группе миопатий, связанных с ColVI.

Детальное изучение различных биологических функций и свойств ColVI имеет принципиальное значение для разработки целевых терапевтических подходов к лечению миопатий, связанных с ColVI. В этой связи мутантные и нокаутные модели животных представляют собой полезный инструмент для трансляционных исследований и для механистического понимания заболеваний человека, связанных с дефектами ColVI.

Col6a1 нокаутные мыши
Наиболее хорошо охарактеризованной животной моделью миопатий, связанных с ColVI, является Col6a1 нокаутная мышь(Col6a1-/-). У этой мыши второй экзон гена Col6a1, кодирующего сигнальный пептид цепи α1(VI), был прерван путем направленной генной дезорганизации второго экзона, что препятствует трансляции цепи α1(VI). Как следствие, даже если цепи α2(VI) и α3(VI) могут быть транслированы, образование мономеров ColVI предотвращается, и, следовательно, не могут синтезироваться и секретироваться в ЭЦМ трехспиральные молекулы ColVI (Bonaldo et al. 1998). Эта модель мыши в значительной степени способствовала раскрытию ряда in vivo ролей ColVI, проливая новый свет на значимость этого компонента ЭКМ в регуляции ряда клеточных процессов.

Col6a3 мышиные модели
Как и в случае с моделью Col6a1-/-мышей, мутантные мыши Col6a3 были получены с помощью направленного отключения генов (Pan et al. 2013, 2014). Одна из моделей мышей (Col6a3hm/hm) имеет внутрикадровую делецию длиной 147 п.н., которая приводит к исключению экзонов 15 и 16 из транскрипта Col6a3, что представляет собой гипоморфную мутацию. В более короткой цепи α3(VI) отсутствует богатый цистеином линкерный сегмент, что приводит к нестабильной сборке трехспирального мономера ColVI. Поэтому у мышей Col6a3hm/hm наблюдается дефицит отложения ColVI в ЭЦМ и внутриклеточное удерживание цепей ColVI (Pan et al. 2013). У таких мышей наблюдаются слабовыраженные миопатические признаки и дефекты соединительной ткани. При гистологическом анализе различных мышц выявлены различия размеров миоволокон, увеличение интерстициальной соединительной ткани и регенерация миофибрилл с центральным расположением ядрер. Однако, в отличие от Col6a1-/-мышей, в мышцах Col6a3hm/hm не наблюдается значительного увеличения экспрессии маркеров апоптоза. Функциональный анализ ex vivo мышц разгибателя голени (extensor digitorum longus) показал снижение мышечной силы (Pan et al. 2013). В целом, животные Col6a3hm/hm демонстрируют миопатические признаки, сходные с Col6a1-/-мышами, хотя и более мягкие.

Danio rerio модели коллаген-6-связанных заболеваний
Зебрафиш (Danio rerio) широко используется для изучения развития и функционирования генов позвоночных. Действительно, благодаря своей прозрачности и быстрому развитию эта рыба представляет собой полезный инструмент для визуализации паттерна экспрессии конкретного гена или активации сигнальных путей во всем организме. Более того, зебрафиш позволяет изучать различные аспекты, связанные с функциями конкретных генов, предоставляя ценную информацию для глубокого понимания развития человека и механизмов заболеваний, в том числе коллагенопатий (Lieschke and Currie 2007; Bretaud et al. 2019). Соответственно, в последние годы были созданы различные зебрафиш-модели коллагеновых миопатий.

В клиническую практику были внедрены различные физиотерапевтические и хирургические вмешательства, направленные на борьбу с наиболее выраженными симптомами миопатий, связанных с ColVI. Они включают в себя применение принудительной вентиляции легких для преодоления дыхательной недостаточности и хирургические вмешательства, направленные на устранение рецидивирующих сухожильных контрактур на различных участках (наиболее часто страдают ахилловы сухожилия) и на лечение прогрессирующего сколиоза (Bönnemann 2011). Такие вмешательства постоянно подкрепляться тщательной осторожностью в анестезиологической практике (Grosu et al. 2012; Martin et al. 2013) и при лечении респираторных инфекций (Lampe and Bushby 2005; Merlini and Bernardi 2008), а также должны сопровождаться сбалансированным питанием (Merlini and Bernardi 2008; Toni et al. 2014).

Несмотря на актуальность таких подходов, специфическая терапия миопатий, связанных с ColVI, которая могла бы привести к окончательному излечению, до сих пор не найдена. Тем не менее, в настоящее время изучается несколько стратегий, и некоторые из них были приняты в клинические испытания с многообещающими результатами. Учитывая обоснование различных подходов, разработанных к настоящему времени, можно выделить два основных направления:
— Нацеливание на генетический дефект, что позволяет восстановить секрецию функциональной формы ColVI.
— Направленность на последующие эффекты генетического дефекта, а именно на клеточные изменения, лежащие в основе патогенетических механизмов заболевания.

Генная терапия, направленная на стабильную или временную модификацию геномной ДНК в клетках пациентов, до настоящего времени не применялась. Это объясняется, с одной стороны, высокой гетерогенностью мутаций ColVI, обнаруженных у пациентов с БМ и ВМД Ульриха и охватывающих четыре различных гена (COL6A1, COL6A1, COL6A1, COL6A1, COL6A1) в нескольких местах (Bushby et al. 2014; Hunter et al. 2015), а с другой стороны, к проблемам безопасности и этики, связанным с подобными подходами: начиная от возникновения «внемишеней» опухолевого генеза, иммуногенных реакций, которые могут быть индуцированы выбранной стратегией, до возможности изменения генофонда детей или даже эмбрионов путем внутриутробной модификации (Cox et al. 2015; DeWeerdt 2018). Альтернативные стратегии ориентированы на РНК, с целью модификации экспрессии мутировавшего аллеля путем регуляции сплайсинга, стабильности или трансляции мРНК. Другими словами, путем введения синтетических сигналов, таких как олигонуклеотиды, двуцепочечные РНК или специфические лекарственные препараты, в клетки, можно принудительно включать/исключать мутировавшие экзоны в зрелый транскрипт, чтобы вызвать или отменить распад определенных последовательностей мРНК, или стимулировать трансляционное считывание преждевременных стоп-кодонов (Le Roy et al. 2009).
На основании обнадеживающих результатов, полученных в клинических испытаниях препарата для лечения мышечной дистрофии Дюшенна, в которой антисмысловые олигорибонуклеотиды (АОН), сконструированные для пропуска экзона 51 МДД, позволили генерировать транскрипт в рамке и частично пропустить экзон 51 ДМД (Cirak et al. 2011), была разработана аналогичная стратегия для коррекции специфических форм доминантно-негативных мутаций в гене COL6. Учитывая, что гаплонедостаточность одной из цепей ColVI, не приводит к какому-либо клинически значимому патологическому фенотипу (Camacho Vanegas et al. 2001; Foley et al. 2011), было выполнено исследование, направленное на таргетирование мРНК, продуцируемую аллелем, представляющим доминантно-негативную гетерозиготную делецию COL6A2, которая, как известно, индуцирует нефункциональную триплегическую ассоциацию (Gualandi et al. 2012). Фибробласты пациентов были трансфицированы 2′-O-метилфосфоротиоатом (2’OMePS), распознающий однонуклеотидный полиморфизм, находящийся в цис-состоянии с мутацией, и предназначенный для индукции пропуска экзона 3 в транскрипте мутировавшего COL6A2. Это вызывает сдвиг рамки считывания в мРНК и в конечном итоге это приводит к нонсенс опосредованному распаду мутировавшего транскрипта, но сохраняет транскрипт, кодируемый нормальным аллелем COL6A2. Как и было предсказано, такой подход привел к усилению секреции и отложения в ЭКМ ColVI с увеличенной микрофибриллярной сетью (Gualandi et al. 2012). В другом исследовании использовался подход, основанный на использовании siРНКb, направленный на наиболее частую мутацию у японских пациентов с ВМД Ульриха, а именно доминантную точечную мутацию в гене COL6A1, которая приводит к полному отсутствию ColVI в ЭКМ. При трансфекции фибробластов пациентов сконструированной siРНК, мутантный транскрипт оказался значительно сниженным по сравнению с нормальным и был обнаружен секретируемый ColVI (Noguchi et al. 2014). Аналогичным образом, siРНК-опосредованное подавление мутации COL6A3, приводящей к пропуску экзона 16, одной из наиболее распространенных мутаций у пациентов с доминантным ВМД Ульриха, вызывало повышенную секрецию и отложение в ЭКМ фибробластов пациентов ColVI (Bolduc et al. 2014). Другая связанная с ВМД Ульриха гетерозиготная делеция COL6A3 в экзоне 15, была таргетирована с помощью гапмерных АОНов (химерных олигонуклеотидов, содержащих центральный блок дезоксирибонуклеотидов), способных гибридизироваться с мутантной мРНК-мишенью, что приводит к опосредованной РНКазой Н-связанной деградации гетеродомена РНК-ДНК. Такой подход позволил селективно подавить экспрессию мутантного транскрипта COL6A3, при этом увеличивается отложение ColVI в ЭКМ (Marrosu et al. 2017).
Самым последним примером такой стратегии стало выявление в группе 35 пациентов с ВМД Ульриха глубокой интронной мутации в гене COL6A1, создающей новый сплайс-акцепторный сайт и вызывающая внутрикадровую вставку в зрелую мРНК (Cummings et al. 2017). Такая вставка вводит дополнительную последовательность в тройной спиральный домен цепи α1(VI), что приводит к доминантно-отрицательному эффекту на осаждение и сборку ColVI в ЭЦМ (Bolduc et al. 2019). Использование различных комбинаций АОНов, направленных либо на сплайс-соединения, либо на внутренние сайты псевдоэкзонов дозозависимым образом подавляет включение псевдоэкзонов в фибробласты, полученные от пациентов, что привело к улучшению отложения ColVI в ЭЦМ, с более толстыми и длинными микрофибриллами. Интересно, что в этой работе авторы также доказали применимость технологии CRISPR/Cas9 к интронным мутациям гена COL6, подобрав специфические gРНК, способные направлять вырезание псевдоэкзона с эффективностью, близкой к 80%, и восстанавливая практически нормальное осаждение ColVI в клетках пациентов (Bolduc et al. 2019). Несмотря на то, что редактирование генов является весьма привлекательно в качестве окончательного и долговременного лечения, применение АОН для лечения миопатий, связанных с ColVI, может обеспечить более быстрый путь для внедрения в клиническую практику, учитывая их благоприятный профиль безопасности. Тем не менее, остается несколько открытых вопросов. До сих пор в стратегиях РНК-мишени, использовавшихся для лечения миопатий, связанных с ColVI использовали клетки пациентов, но их эффективность для скелетных мышц еще предстоит доказать. Кроме того, до сих пор неизвестно, является ли ранее депонированный ЭКМ и/или аномально организованная мутантная ColVI препятствием для правильного осаждения и сборки новой исправленной ColVI в ЭКМ мышцы.

Первым шагом на пути к разработке терапии стало неожиданное открытие ППП-зависимой митохондриальной дисфункции, вызванной дефицитом ColVI. Как подробно описано в предыдущем разделе, обнаружение значительных ультраструктурных изменений, затрагивающих митохондрии и СР, в клетках с дефицитом ColVI, сопровождавшееся увеличением спонтанного апоптоза, вызвало интерес к исследованию наличия митохондриальной дисфункции, связанной с изменением кальциевой нагрузки (Irwin et al. 2003). Действительно, если в базальных условиях Δψm покоя изолированных Col6a1-/-миофибриллы не отличались от таковых у Col6a1-/- от миоволокон дикого типа, то при обработке олигомицином — ингибитором АТФ-синтазы F1FO, часто используемым для изучения функции митохондрий in vitro и вызывающим нагрузку на миоволокна дикого типа, — Δψm покоя не изменялся (Antoniel et al. 2014; Li et al. 2014; Fisher-. Wellman et al. 2018). Он вызывал быструю деполяризацию митохондрий в миофибриллах Col6a1-/- мышей. Это показало, что в отсутствие ColVI нарушенное митохондриальное дыхание индуцирует потребление АТФ АТФ-синтазой F1FO, работающей в обратном направлении как гидролаза, для преодоления повышенной проницаемости и поддержания надлежащего протонного градиента (Bernardi et al. 2001; Irwin et al. 2003). Переход проницаемости, вызывающий деполяризацию митохондрий, опосредован повышенным открытием ППП, которое, как известно, индуцируется перегрузкой матрикса митохондрий Ca2+ и потенцируется ROS (Bernardi et al. 2001; Šileikytė and Forte 2019). Олигомицин-индуцированная митохондриальная деполяризация, проявляющаяся в изолированными миофибриллами Col6a1-/-, может быть восстановлена путем:
(1) помещением их на нативный ColVI, что подтверждает прямую связь между отсутствием внеклеточного ColVI и дефектом митохондрий;
(2) обработкой хелаторами Са2+, такими как мембранопермеатирующий реагент BAPTA/AM, что подтверждает прямую связь между отсутствием внеклеточного ColVI и дефектом митохондрий;
(3) лечением CsA, хорошо известным ингибитором ПТП, но не CsH, аналогом, не способным ингибировать ППП, что указывает на открытие ППП как на первую лекарственную мишень в патогенезе ColVI (Irwin et al. 2003).
Эти результаты ex vivo вызвали интерес к проверке эффективности CsA in vivo. Действительно, CsA оказался весьма эффективным средством борьбы с миопатическими дефектами Col6a1-/-мышей, заметно улучшив структуру и функцию мышц (Irwin et al. 2003; Grumati et al. 2010).
Перенос результатов, полученных на мышах, на пациентов потребовал in primis поиска аналогичных патофизических дефектов в биоптатах и клеточных культурах пациентов, страдающих миопатиями, связанными с ColVI. С этой целью была изучена группа пациентов, представляющая спектр тяжести ВМД Ульриха, что позволило выявить повышенную частоту встречаемости апоптоза в биоптатах мышц и в первичных культурах мышц по сравнению с контрольной группой (Angelin et al. 2007). Что еще более важно, аномальный ответ на олигомицин, наблюдаемый в миофибриллах мыши Col6a1-/-, был продемонстрирован и клетками пациентов. Клетки пациентов демонстрировали быструю митохондриальную деполяризацию, которая восстанавливалась при пересадке клеток на ColVI, а также при обработке клеток CsA, что подтверждает роль участия ППП в дефиците ColVI (Angelin et al. 2007). В том же исследовании показано, что неиммуносупрессивный аналог CsA, известный как Debio 025 или алиспоривир (Hansson et al. 2004), способен противодействовать митохондриальной дисфункции и снижать частоту апоптоза в клетках больных (Angelin et al. 2007). Это позволило сформулировать концепцию, согласно которой основным недостатком таргетного воздействия на ППП у пациентов с миопатиями, связанных с ColVI, а именно нежелательной иммуносупрессии, вызываемой CsA, можно обойти путем десенсибилизации открытия ППП с помощью более специфического ингибитора Cyp-D, модифицированным таким образом, чтобы предотвратить его взаимодействие с кальциневрином, и, следовательно, без влияния на иммунную систему.
Эти результаты послужили основой для разработки первого пилотного клинического исследования с применением CsA при миопатиях, связанных с ColVI. Принимая во внимание, что число пациентов с БМ/ВМД Ульриха с известными мутациями ColVI относительно невелико, наряду с большой вариабельностью генотипа-фенотипа и потенциальным риском побочных эффектов, вызываемых применением иммуносупрессивного препарата, было проведено краткосрочное открытое исследование с использованием CsA в одном из пациентов с БМ и четырех пациентах с ВМД Ульриха, трое из которых были педиатрического возраста, а двое – взрослые (Merlini et al. 2008). Пациенты получали 5 мг/кг CsA в сутки в течение одного месяца — выбранная доза находится в нижнем диапазоне доз, используемых для иммуносупрессивной терапии с целью оценки в качестве основной биологической конечной точки — функции митохондрий и апоптоза в биоптатах, взятых до и после введения CsA. Это потребовало тщательной оптимизации процесса выделения мышечных клеток из биоптатов пациентов и условий культивирования, а также протоколов для измерения влияния CsA на Δψm ex vivo. Это пилотное клиническое исследование продемонстрировало способность CsA восстанавливать олигомицин-зависимую митохондриальную деполяризацию и снижать частоту апоптоза в биоптатах мышц пациентов (Merlini et al. 2008a). Кроме того, были обнаружены значительные признаки регенерации миофибрилл, особенно у молодых пациентов, что свидетельствует о благоприятном влиянии CsA на регенерацию мышц (Merlini et al. 2008a), что и подтвердилось в последующих исследованиях на Col6a1-/-мышах (Gattazzo et al. 2014a). Это пилотное исследование представляет собой знаковое достижение для исследований ColVI и для пациентов, страдающих миопатиями, связанными с ColVI, которые впервые увидели перспективу лечения своего заболевания. Действительно, родители трех детей, включенных в исследование, попросили продолжить прием препарата после завершения месячного исследования. Еще трое детей были дополнительно включены во второе проспективное долгосрочное, открытое и несравнительное пилотное клиническое исследование, в котором пациенты с ВМД Ульриха в возрасте от 5 до 9 лет принимали по 3-5 мг/кг CsA ежедневно в течение 1-3,2 лет (Merlini et al. 2011). В этом исследовании первичной конечной точкой была клиническая, определяемая как увеличение мышечной силы, а вторичной — влияние CsA на изменение мышечной массы, двигательной функции и дыхания. Результаты оказались обнадеживающими, поскольку у пяти из шести молодых пациентов с УКМД, включенных в исследование, наблюдалось статистически значимое увеличение мышечной силы. К сожалению, это не сопровождалось изменением двигательной функции, и, несмотря на положительную динамику силы мышц конечностей, CsA не смог противодействовать прогрессирующему снижению дыхательной функции (Merlini et al. 2011). Лечение хорошо переносилось пациентами, при этом побочные эффекты были связаны с нарушением функции почек, гипертензией, головной болью, желудочно-кишечными расстройствами и гирсутизмом. Полученные результаты послужили толчком к поиску неиммуносупрессивных альтернатив CsA, которые можно было бы использовать как можно раньше у пациентов с ВМД Ульриха, когда когда диафрагма менее скомпрометирована и ее регенеративный потенциал еще высок. Для достижения этой цели были разработаны препарат Debio 025 (алиспоривир) и другая неиммуносупрессивная молекула, полученная путем модификации CsA, — NIM811 (Waldmeier et al. 2002), они были испытаны на доклинических моделях животных. Дебио 025 оказался способен восстанавливать вызванную олигомицином митохондриальную деполяризацию, а также спонтанный апоптоз и ультраструктурные дефекты митохондрий и СР у Col6a1-/- мышей (Tiepolo et al. 2009). Аналогичным образом NIM811 был успешно протестирован на эмбрионах зебрафиш col6a1 exon 9 и на мышах Col6a1-/-, показав свою эффективность не только в восстановлении ультраструктурных аномалий, скрытой митохондриальной дисфункции и апоптоза мышц, но и в значительном восстановлении двигательной функции у морфантов зебрафиш и тетанической силы у ColVI null мышей (Zulian et al. 2014). Перенос этих терапевтических подходов от стенда к постели больного относительно возможен, поскольку фармакокинетика и безопасность препарата Debio 025 уже были проверены в клиническом исследовании II фазы (Flisiak et al. 2009), а в последнее время этот препарат вновь стал объектом внимания.

Другие стратегии уже вошли в клиническую практику, показав многообещающие результаты в противодействия некоторым основным патофизиологическим признакам ColVI-ассоциированных миопатий. Эти стратегии относятся ко второму типу подходов, направленных на воздействие на клеточные события, запускаемые дефицитом ColVI. В этом контексте была использована Col6a1-/- мышиная модель (Bonaldo et al. 1998). Она остается ценным инструментом, который позволил за несколько лет выявить и препарировать ряд патофизиологических дефектов in vivo, а также получить представление о молекулярных механизмах, лежащих в основе мышечной патологии, вызванной дефицитом ColVI. Исследования, проведенные на мышах Col6a1-/-, позволили получить богатейшую информацию, которая открыла поле для дальнейших исследований на биоптатах мышц пациентов и первичных культурах.

Несмотря на то, что основные усилия по переводу терапевтических подходов в клиническую плоскость были направлены на десенсибилизацию ППП, рассматривались и другие клеточные мишени.

В обширной литературе подтверждается, что окислительный стресс и генерация ROS могут вносить вклад в патофизиологию мышечных дистрофий (Terrill et al. 2013; Canton et al. 2014; Serra et al. 2018).  В мышцах Col6a1-/- мышей наблюдается повышенный уровень РОС, сопровождающийся увеличением экспрессии и активности МАО.

Было установлено, что лечение in vivo ингибитором МАО паргилином уменьшает продукцию ROS и устраняет апоптоз миофибрилл у Col6a1-/-мышей, наряду с увеличением мышечной силы и улучшением локомоторных показателей (Menazza et al. 2010). Эти данные свидетельствуют о значительной роли ROS в окислении миофибриллярных белков и в гибели клеток в ColVI-дефицитных мышцах. Мышцы, пораженные ColVI, указывают на МАО как на новые мишени, способные противодействовать прогрессированию заболевания. Эта концепция была проверена на миобластах, полученных от пациентов с БМ и ВМД Ульриха, и показала, что лечение паргилином in vitro снижает восприимчивость клеток к окислительным процессам, противодействует деполяризации митохондрий и снижает проявление апоптоза (Sorato et al. 2014). Эти результаты обосновывают целесообразность использования таргетного воздействия на активность МАО в качестве перспективной терапевтической стратегии для борьбы с миопатиями, вызванными ColVI.

Другой метод лечения, направленный на ось ColVI-апоптоз и, как предполагается, имеющий возможность войти в клинические испытания, — омигапил. В клинических испытаниях может участвовать молекула омигапила, производимая компанией Santhera Pharmaceuticals. Эта молекула, обладающая сильным антиапоптотическим действием и ранее признанная неэффективной в отношении болезни Паркинсона и бокового амиотрофического склероза (Olanow et al. 2006; Miller et al. 2007), затем была протестирована на предмет использования в качестве лекарственного средства при врожденных мышечных дистрофиях. Действительно, омигапил был применен в животных моделях ламинин-2-дефицитной врожденной мышечной дистрофии MDC1A (Erb et al. 2009; Yu et al. 2013), и было обнаружено, что он способен уменьшать апоптоз и ультраструктурных изменений в миофибриллах Col6a1-/-мышей (неопубликованные данные).

Предыдущие исследования показали, что эта молекула вмешивается в проапоптотический сигнальный путь S-нитрозилирование GAPDH: S-нитрозилированный GAPDH связывается с E3-убиквитин-лигазой Siah1, что запускает его транслокацию в ядро, где через вовлечение ацетилтрансферазы CBP/p300 GAPDH активирует транскрипцию проапоптотических генов, включая p53, PUMA и p21 (Chuang et al. 2005; Sen et al. 2008).

В 2013 году в клиническое исследование под названием «CALLISTO» были включены пациентов в возрасте от 5 до 16 лет, страдающих миопатиями, связанными с ColVI или с LAMA2, с целью оценки безопасности и переносимости различных доз омигапила и его фармакокинетики у педиатрических пациентов. Данное исследование было завершено в 2017 году (ClinicalTrials.gov NCT01805024), однако результаты по омигапилу пока не опубликованы. Несмотря на это, в ходе исследования был получен ряд клинических параметров в когорте пациентов, наблюдавшихся в течение двух-четырех лет, что может иметь значение для оценки эффективности любого другого дальнейшего лечения у пациентов с педиатрической с ColVI (Meilleur et al. 2015; Bendixen et al. 2017; Nichols et al. 2018; Jain et al. 2019).

Другая линия вмешательства, дополняющая ту, которая направлена непосредственно на митохондриальные изменения, ориентирована на аутофагический путь.

При исследовании механизмов, ответственных за персистенцию измененных митохондрий в ColVI-дефицитных миофибриллах, аутофагия оказалась одним из основных путей, который был нарушен. У Col6a1-/-мышей в базальных условиях и при 24-часовом голодании, снижался аутофагический поток, сдерживаемый избыточным фосфорилированием Akt и опосредованный дефектными уровнями Beclin 1 и Bnip3. Параллельно с этим в биоптатах пациентов наблюдается снижение уровня этих двух эффекторных белков аутофагии (Grumati et al. 2010). Кроме того, актуальным является вопрос о том, чтобы поставить аутофагию в центр внимания терапевтических стратегий, направленных на борьбу с БМ и ВМД Ульриха. Этот путь может быть модулирован в мышиной модели Col6a1-/- вплоть до восстановления миопатического фенотипа (Grumati et al. 2011a). Действительно, лечение in vivo хорошо известным проавтофагическим препаратом рапамицином способно индуцировать аутофагию, что привело к уменьшению дефектов миофибрилл. Более того, длительное 30-часовое голодание, а также ЛПД в течение четырех недель успешно восстанавливали все характеристики миофибрилл, включая аутофагический поток, ультраструктуру органелл, митохондриальную дисфункцию и апоптоз, а также заметное увеличение силы мышц (Grumati et al. 2010).

Среди множества подходов, использованных на Col6a1-/-мышах и способных реактивировать аутофагию в скелетных мышцах, наиболее привлекательными для человека представляются подходы, основанные на питании, поскольку они позволяют избежать неблагоприятных иммуносупрессивных эффектов, вызываемых длительным лечением рапамицином или CsA.

Полученные результаты были воплощены в пилотное клиническое исследование, направленное на проверку эффективности 1-годичной нормокалорийной ЛПД в активации аутофагии в мышцах пациентов с БМ и ВМД Ульриха (ClinicalTrials.gov NCT01438788). Первичной конечной точкой исследования было повышение уровня белка Beclin1 в биоптатах мышц по сравнению с исходным уровнем, но значимость этого исследования гораздо шире. В исследование были включены семь взрослых пациентов, страдающих БМ или ВМД Ульриха, и оно привело к безопасной и эффективной реактивации аутофагии (Castagnaro et al. 2016). Это сопровождалось снижением частоты апоптоза миофибрилл, что свидетельствует о положительных сдвигах в мышечном гомеостазе, а метаболические изменения указывают на улучшение функции митохондрий. Следует отметить, что 1-летняя ЛПД оказала положительное влияние на снижение функциональных параметров, при этом не было отмечено значительного ухудшения ни одного параметра мышечной силы и улучшились двигательные и дыхательные функции (Castagnaro et al. 2016).

Организация данного клинического исследования на основе ЛПД потребовала в качестве предварительного условия детального изучения пищевого и метаболического статуса пациентов, включенных в исследование, что, в свою очередь, позволило углубить понимание влияния энергетического метаболизма на состав тела и мышечную силу у пациентов с коллагенопатией (Toni et al. 2014). Примечательно, что это исследование позволило также установить, что лейкоциты крови являются неинвазивным биомаркером, способным зеркально отражать и тем самым выявлять аутофагический статус мышц пациентов, что является ценным инструментом для мониторинга эффективности будущих методов лечения, направленных на реактивацию аутофагии (Castagnaro et al. 2016). Кстати, как подчеркивают сами авторы, значение данного пилотного клинического исследования не заключалось в продвижении ЛПД в качестве идеального долгосрочного метода лечения патологии ColVI — также учитывая ограничения, связанные с отсутствием контрольной группы, получавшей стандартную диету, но в том, чтобы продемонстрировать, что модуляция мышечной аутофагии с помощью пищевого вмешательства достижима и безопасна, не влечет за собой каких-либо специфических побочных эффектов, связанных с приемом синтетического препарата (Castagnaro et al. 2016).

Одно из главных преимуществ таргетинга аутофагии заключается в том, что она легко настраивается с помощью диеты или различных нутрицевтиков (Madeo et al. 2019). Действительно, концепция лечения заболеваний человека с помощью нутрицевтических пищевых добавок является особенно привлекательной в свете различных примеров, которые уже продемонстрировали положительный эффект в доклинических и клинических условиях (Maiuri and Kroemer 2019).

Среди наиболее эффективных индукторов аутофагии, обнаруженных в натуральных продуктах питания и уже применяемых для борьбы с заболеваниями человека, можно назвать:
1. Стилбеноиды, например, ресвератрол: содержится в винограде, арахисе, ягодах, других растениях и их производных, включая красное вино и соки; его свойства особенно ярко проявляются при кардиопротекции и нейродегенеративных заболеваниях (Sun et al. 2010; Kakoti et al. 2015).
2. Полиамины, например, спермидин: содержится в фасоли и других бобовых, сое и ее производных, грибах, выдержанном сыре; показано, что он увеличивает продолжительность жизни в различных организмов и обладает защитными свойствами в ряде тканей, включая сердце, мозг, мышцы (Eisenberg et al. 2009, 2016; Kiechl et al. 2018).
3. Природный дисахарид трегалоза: содержится в дрожжах, морских водорослях, семенах подсолнечника и грибах; считается проаутофагическим индуктором, действующим на лизосомальный биогенез лизосом, обладающий перспективными нейропротекторными эффектами (Rusmini et al. 2019; Khalifeh et al. 2019).

Интересно отметить, что, при введении спермидина Col6a1-/- мышам как per os, так и путем внутрибрюшинной инъекции, удалось реактивировать аутофагический потока в мышцах, корректировать ультраструктуры органелл и дефектов миофибрилл, а также снизить частоту спонтанного апоптоза (Chrisam et al. 2015).

Дальнейшие исследования на мышах выявили сильное положительное влияние других нутрицевтиков, индуцирующих аутофагию, таких как стилбеноиды, в улучшении структуры и функции мышц, а также в противодействии их разрушению (Metti et al. 2020).

Эти данные подчеркивают широкие возможности нутрицевтиков в лечении патологий COL6 и поддерживают спермидин в качестве кандидата для будущих испытаний в этом контексте. Более того, учитывая, что спермидин и ресвератрол активируют аутофагию путем модуляции как ядерного, так и цитозольного ацетилпротеома через различные механизмы и конвергентным образом (Morselli et al. 2011; Madeo et al. 2018), можно ожидать синергетического эффекта от комбинированного нутрицевтиков.

К настоящему времени предприняты огромные усилия по поиску безопасного лекарства для лечения ColVI миопатий. Достигнутые за последнее десятилетие успехи, касающиеся точности и эффективности редактирования генов и молекулярных инструментов, а также детальная проработка точности и эффективности редактирования генов и молекулярных инструментов, а также детальные знания о биологических путях, участвующих в патогенезе ColVI миопатий, открывают огромные возможности в поиске лекарств для пациентов. В ближайшем будущем они могут позволить затормозить прогрессирование заболевания в сочетании с ранней диагностикой у детей.

1. Darras et al. Neuromuscular disorders of infancy, childhood, and adolescence. A clinician’s approach. 2015
2. Hilton-Jones et al. Oxford textbook of neuromuscular disorders. 2014
3. Wattjes et al. Neuromuscular imaging. 2013
4. Ruggiero. The collagen superfamily and collagenopathies. 2021

Перевод на русский язык и адаптацию материалов выполнила Бережная Е.Н.

Ознакамливаясь с любыми материалами, подготовленными МОО “Проект Ай-Мио” (далее также — Организация), Вы соглашаетесь с тем, что они могут быть использованы Вами в некоммерческих целях и размещены на Ваших ресурсах, (сайтах, группах социальных сетей, чатах мессенджеров и др.) только с согласия Организации.

Под материалами МОО “Проект Ай-Мио” понимаются:

— переведенные статьи, в том числе научные, посвященные тематике нервно-мышечных заболеваний;

— любые справочные и авторские материалы;

— брошюры;

— руководства, методические рекомендации;

— пошаговые алгоритмы, разъясняющие видеоролики и кейсы;

— другие материалы, которые защищены авторским правом в соответствии с законодательством РФ.

Для согласования использования материалов МОО ”Проект Ай-Мио”, Вы можете направить официальное письмо по адресу: berezhnaya.e@i-mio.org.

Если материалы МОО “Проект Ай-Мио” будут использованы без соответствующего разрешения, то Организация вправе требовать:

• удаления данных материалов с ресурсов, где они были незаконно размещены;
• возмещения убытков и восстановления нарушенного права в досудебном и судебном порядке.